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鑑定第四型與第九型雙胜肽蛋白水解酶之生物化學特性

為了解決Demonstration senten的問題，作者唐弘寬 這樣論述：

脯胺酸雙胜肽蛋白水解酶 (prolyl dipeptidase) 家族，具有從胜肽上移除N端第二個脯胺酸殘基的功能。家族成員包括有第二型、第四型、第八型、第九型雙胜肽蛋白水解酶 [DPPII (E.C. 3.4.14.2)、DPP-IV (EC 3.4.14.5)、DPP8及DPP9] 及纖維母細胞激活蛋白(fibroblast activation protein，FAP)。其中第四型雙胜肽蛋白水解酶已有廣泛的研究。然而，其餘的家族成員之生物功能至今仍尚未被解析。其中，第八型及第九型雙胜肽蛋白水解酶在其胺基酸序列有58%相同。 首先，本論文著重於鑑定第九型雙胜肽蛋白水解酶的生物化學特

性，包括其酵素活性、四級結構、受質特性選擇 (substrate profile) 及酸鹼值最適範圍。第九型雙胜肽蛋白水解酶的表現是利用昆蟲細胞表現系統，在Strep•TactinTM的純化系統中純化。在此表現系統中，我們所得到的產率相較於文獻中所發表的數值，有約100倍的提升。生物化學鑑定的結果顯示，第九型雙胜肽蛋白水解酶在其酵素活性、受質特性選擇和酸鹼值最適範圍，皆類似於第八型雙胜肽蛋白水解酶。且其四級結構皆為雙聚體 (homodimer)。第九型雙胜肽蛋白水解酶位於雙聚體組合的接合面 (dimer interface) 之定點突變株 (F842A)，經表現純化後，發現其四級結構亦為二聚體

，但其酵素活性相較於野生型減低了約300倍。根據我們實驗室先前的研究成果，這結果顯示出第九型雙胜肽蛋白水解酶的二聚化(dimerization) 的形式是近似於第八型雙胜肽蛋白水解酶。因此，第八型及第九型雙胜肽蛋白水解酶的生物化學特性是相當類似。我們推論第八型及第九型雙胜肽蛋白水解酶在生物體內可能扮演著同樣的角色。另外，在纖維母細胞、表皮細胞及血球細胞中，我們發現第八型及第九型雙胜肽蛋白水解酶皆有表現，且相互之間的表現量並無顯著差異。而且，和文獻中的所發表的不同的地方在於，我們的研究發現第八型與第九型雙胜肽蛋白水解酶的表現，在T細胞活化前與活化後，其表現量沒有顯著的差異。 第四型雙胜肽蛋

白水解酶為第二型糖尿病之藥物標的(drug target)。文獻中指出，藥物在抑制第四型雙胜肽蛋白水解酶時，若有第八型及第九型雙胜肽蛋白水解酶的酵素活性同時被抑制，會有動物體內毒性的問題。然而，目前並無確切的證據，指示出第八型及第九型雙胜肽蛋白水解酶的抑制為導致動物體內毒性的原因。我們利用對第八型及第九型雙胜肽蛋白水解酶具有高度選擇性的抑制劑 (名為1G244)，於大鼠 (Sprague-Dawley rat) 內進行實驗。結果顯示，1G244的Ki值對於第八型雙胜肽蛋白水解酶，相較於文獻中所使用的結抗劑 (DPP8/9 selective)，其值小了15倍；而對於第九型雙胜肽蛋白水解酶，1G

244的Ki值相較於DPP8/9 selective小了8倍。顯示出1G244較DPP8/9 selective有更強的抑制效果。另外，我們的結果發現，1G244很快的被細胞所吸收。相對的，DPP8/9 selective幾乎無法進入細胞。在動物實驗中，實驗結果指出1G244在大鼠以靜脈注射的方式給藥14天，經檢測血液學及血清學的參數後，僅發現輕微的副作用。綜合以上結果，顯示出第八型及第九型雙胜肽蛋白水解酶的抑制，對動物並不會產生嚴重的毒性。而先前文獻中的結果，可能是由於所謂的”off-target”的現象。因為所使用的結抗劑 (DPP8/9 selective) 無法進入細胞，進而達到抑制第

八型及第九型雙胜肽蛋白水解酶。而其所觀察到的毒性反應，很可能是因為抑制了其它未知的酵素或蛋白質所導致。 最後，我們研究propeller環，對第四型與第九型雙胜肽蛋白水解酶的活性及結構上所扮演的角色。Propeller環為propeller功能性區塊上所延伸出來的小片段，座落在雙聚體組合的接合面 (dimer interface) 上。對脯胺酸雙胜肽水解酶而言，propeller環所扮演的角色至今仍未明瞭。由於第九型雙胜肽蛋白水解酶的結構至今仍未被解析，我們根據其胺基酸序列和其它脯胺酸雙胜肽水解酶的序列排比，以及文獻中與第八型雙胜肽水解酶的電腦模擬，推估其propeller環的位置。我們

針對酵素演化保留殘基 (conserved residue) 做四個定點突變，包括V319A、E325A、K328A及Y334A，以及將propeller環去除的突變 (DEL)。經由表現及純化後，結果發現在V319A、E325A及K328A的突變株中，酵素活性及雙聚體的四級結構皆和野生型的第九型雙胜肽水解酶相似。相對的，Y334A及DEL的突變株中，其酵素活性相較於野生型有所減低 (動力學常數kcat值下降，Km值上升)。 而對第四型雙胜肽水解酶，propeller環相較於第九型雙胜肽水解酶，對其酵素活性及四級結構有不同的影響。根據解析出的結構，我們將propeller環分為兩個部份探

討：intermolecular及intramolecular interaction，其中Y248為intermolecular interaction，而Y238及Y256為intramolecular interaction。在intermolecular interaction方面，我們將Y248做三個定點突變，包含Y248F、Y248T及Y248A，以及將propeller環去除的突變 (Del)。結果顯示出Y248上的phenyl group對雙聚體的形成相當重要。在沒有phenyl group的突變株中，包括Y248T、Y248A及Del，四級結構皆為單聚體而非雙聚體，且活性相較

於雙聚體有下降的情形，或無法測得。其中Y248A及Del的單聚體其活性無法測得，而Y248T的雙聚體其動力學常數kcat值下降，Km值不變。不同的Km值影響效應，顯示出hydroxyl group可能對第四型雙胜肽蛋白水解酶與受質的黏合，扮演重要的角色。在intramolecular interaction方面，Y238A及Y256A的突變株同時有雙聚體及單聚體產生。值得一提的是，其單聚體的酵素活性和雙聚體相似。此一結果和我們先前所發表的結果不同。先前的研究中皆指出單聚體的第四型雙胜肽蛋白水解酶，酵素活性相較於雙聚體，都有下降的情形。未來，我們會針對有活性的單聚體，深入的了解其機轉。總而言之，

我們的結果顯示出propeller環，對第四型及第九型雙胜肽蛋白水解酶的結構及酵素活性有著不同的影響。了解propeller環對脯胺酸雙胜肽蛋白水解酶家族的結構及酵素活性的影響，將會幫助了解脯胺酸雙胜肽蛋白水解酶在biogenesis及雙聚體的形成。

CD30在何杰氏病之功能角色

為了解決Demonstration senten的問題，作者蘇哲俊 這樣論述：

CD30表現在何杰氏病(Hodgkin’s disease, HD)的腫瘤細胞 (Hodgkin’s Reed-Sternberg cells, H-RS cells) 表面，隸屬腫瘤壞死因子受器(Tumor Necrosis Factor receptor, TNFR)家族的一員。血清中存在有游離型CD30 (sCD30)，為細胞膜上的CD30 經酵素水解後的產物。血清中sCD30值在包括HD等諸多疾病中均有顯著增加，且其數值高低與病情及癒後密切相關，但其在生體中的弁鄖丹滮揭釩暐蝎M。對CD30的免疫弁鄖丹漶A我們發現CD30，不論是以細胞膜蛋白的型式(在H-RS細胞表面或是穩定表現CD3

0之CHO細胞株的細胞膜上)，或是plate-bound CD30-Fc融合蛋白型式，都能有效地抑制T細胞的增生(proliferation) 以及抑制CD25、CD26等表面蛋白在T細胞的表現。而抑制T細胞增生的機轉，可能與抑制T細胞製造IL-2有關。先前的研究也顯示HD病人之病灶組織的T細胞其CD25、CD26等表面蛋白也顯著減少。這些實驗證據幫助我們解釋為什麼H-RS腫瘤細胞在眾多T細胞環伺之惡劣環境下依舊能夠生存發展﹕H-RS腫瘤細胞能藉由CD30抑制T細胞的增生與活化，來壓制免疫反應(immunosuppression)並提高免疫系統對該腫瘤細胞的容忍性(tolerance)，進而促

成一個有利於腫瘤細胞生存與增生的環境。我們發現CD30經由CD30 ligand (即CD153)的訊息傳導來影響T細胞的免疫弁遄A為更深入探討CD30在生物體之弁鄔囧丹漶A提供了有利的基礎。